니켈은 인체에 필요한 필수미량원소이면서 과량이 흡수되거나 노출되면 지연성 과민반응(type IV h y p e r s e n s i t i v i t y )의 일종인 접촉성 피부염 및 자극 증상을 일으키는 대표적인 금속으로서, 최근 인체내 에 삽입되는 의료용 합금의 생산 및 산업분야에서의 사용증가로 인체폭로 또한 증가하고 있다(Lacy 등, 1996; Ermoli 등, 2001). 이에 따라 니켈에 대한 독성연구가 활발히 진행되고 있다. 생체의 면역체계에 영향을 미치는 금속은 최근 면 역반응의 지표로 알려진 nitric oxide(NO)와 밀접 한 관련성이 존재한다고 보고되고 있다( E v a n s , 1993; Tian과 Lawrence, 1996). 또한 병원체의 침입에 의한 염증반응에서, T-세포에서 분비되는 IL-1, TNF 등과 같은 c y t o k i n e s의 분비에 의해 대식세포의 inducible nitric oxide synthase ( i N O S )가 활성화되어 대량 생성된 N O가 세포독성 을 일으키므로써 면역기능을 수행한다( S n y d e r와 Bredt, 1992). 이러한 과정은 니켈이라는 항원에의 노출로 자극된 T -세포가 분비하는 IL-1, TNF 등과 같은 c y t o k i n e이 대식세포를 활성화시켜 염증반응 이 나타나는 전형적인 대식세포 매개형 지연성 과민 반응의 과정(Roitt 등, 1989; Veronesi, 1998)과 흡사하다. 또한 일부 연구보고에서는 니켈이 대식세 포의 NO 생성을 증가시키는 것으로 보고하고 있어 ( T i a n과 Lawrence, 1996), 일종의 면역반응인 지연성 과민반응(type IV hypersensitivity)을 나 타내는 것으로 알려진 니켈(Lacy 등, 1996)의 세 포독성 또한 N O와 밀접한 관련성이 있을 개연성이 있을 것으로 사료된다. 그러나 이러한 연구들은 니 켈에 의한 세포독성에 있어서 염증반응 유발과정이 나 관련 매개물질에 대해서는 정확히 제시하지 못하 고 있다. 한편, NO의 세포독성에 대한 그간의 연구들은, 활성화된 대식세포(activated macrophage)가 동 시에 생성하는 N O와 s u p e r o x i d e ( O2 – )가 결합하여 형성된 p e r o x i n i t r i t e (-O O N O )에 의해 매개되는 것 으로 보고하고 있다(Ischiropoulus 등, 1992; H u i e와 Padmaja, 1993). 이렇게 형성된 -O O N O 는 일종의 자유기(free radical)로서 세포막의 지질 과산화(lipid peroxidation)의 촉진(Radi 등, 1991a) 및 i r o n s u l f u r ( F e – S )집합체를 갖는 효소 등의 분자구조에 반응하여 iron-sulfur-nitrosyl 복 합체를 형성하므로써 효소의 기능을 억제(Radi 등, 1991b; Kolb와 Kolb-Bachofen, 1992; Snyder 와 Bredt, 1992)하여 세포막이나 세포소기관막에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러 한 보고와는 다르게 일부 대식세포를 대상으로 연구 한 보고들에서는, NO의 세포독성은 -O O N O보다는 superoxide dismutase(SOD)에 의해 O2 -로부터 전환되는 hydrogen peroxide(H2O2)와의 상호작용 에 의해 유발된다(Stamler 등, 1992)거나, 대식세 포에 의한 NO 생성시 전구물질인 L – a r g i n i n e이 부 족한 경우에는 i N O S가 H2O2의 생산을 증가시킨다 (Pou 등, 1992)고 보고되고 있어 N O의 세포독성 에는 직·간접적으로 H2O2가 관련되어 있음을 제시 하고 있다. 이에 본 연구에서는 RAW 264.7 cell의 배양조건 에 니켈, iNOS의 competitive inhibitor인 N G – monomethyl-L-arginine(NMLA)(Hibbs 등, 1987; Moncada 등, 1991; Green과 N a c y , 1993), antioxdant인 catalase, 그리고 GSH 보 호물질인 D T T를 여러 조건으로 처리하여 NO 및 H2O2 생성의 변조유무 및 이와 관련된 ATP 생성, 세포 내 GSH 및 세포생존율의 변조양상을 관찰하 므로써 니켈의 세포독성을 매개하는 물질을 파악하 고 그 기전을 제시하고자 한다.
O b j e c t i v e s: Nickel (Ni) is present in many industrial working environments and consumer products, and is one of the leading cause of allergic contact dermatitis, which is a typical delayed (type IV) hypersensitivity reaction. However, the mechanism by which nickel causes this pathology is not well known. The contact dermatitis induced by nickel is mediated, primarily, through macrophages. This property was similar to autotoxicity related nitric oxide (NO) production. NO mediated cytotoxicity was dependent on both H2O2 and peroxynitrite (OONO- ). The purpose of this study was to elucidate the role of NO/H2O2 in the cytotoxicity induced by nickel. Therefore, this study was designed to examine whether nickel could modulate NO/H2O2 production and how the Ni may affect ATP production, intracellular GSH level, and cell viability. Methods: This study was based on the observations of cultures of RAW 264.7 cells, which originated from a tumor in a Balb/c mouse that had been induced by the Abelson murine leukemia virus. RAW 264.7 cells were treated with either Ni, N-monomethyl-L- arginine (NMLA), catalase, and DTT for 24-72 h. The cytotoxicity of the nickel was measured via the cell viability and NO2 – , H2O2, GSH, and the mitochondrial function was evaluated by the adenosine triphosphate (ATP) production in the RAW 264.7 cells. Results: The NO2 – synthesis of RAW 264.7 cells increased with the increase in concentrations of Ni up to 50-μM, after 24 and 48 h of exposure, but then decreased at concentrations greater than 50-μM, and with time periods exceeding 48 h. In contrast, viability of cells and intracellular GSH level decreased in the presence of Ni in a dose and time dependent manner. However, the H2O2 synthesis of RAW 264.7 cells was not changed in the all experimental conditions. The NO2- synthesis of the cells was higher than control, whereas ATP, GSH and viability were lower than control in addition of Ni and the pretreatment of catalase or DTT prior to addition of Ni. Conclusions: These results suggest that NO plays an important role in the cytotoxicity of Ni. Cytotoxicity of Ni may exert through modulation of NO production and associate with a decrease in intracellular GSH levels.
